活细胞内钙离子检测

1 实验简介

Fluo-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在506 nm处被吸收，可以被氩离子激光的488 nm激发光激发，便于检测。Fluo-3在没有同钙结合的情况下，无荧光产生。但是，在与钙结合后，荧光（526 nm）增强至少40倍。Fluo-3/AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3/AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3/AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，***激发波长为506 nm，***发射波长为526 nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488 nm左右，发射波长为525-530 nm。

2 实验步骤

1.用激光共聚焦专用培养皿培养细胞。去除培养基后，用PBS洗涤细胞，然后加入适量含有fluo-3/AM的PBS缓冲液（fluo-3/AM终浓度为0.5-5 μM），置于37℃避光孵育 30分钟。探针浓度和负载时间需要根据细胞类型进行调整，可查阅文献。

2.用PBS溶液轻洗2次，再加入PBS缓冲液，继续孵育20 min，37℃，确保fluo-3/AM在胞内完全水解成fluo-3。

3.用LCSM采集荧光信号，激发波长488 nm，发射波长525 nm。

注意： 此处理方法适用于贴壁细胞。如果是悬浮细胞或半悬浮细胞，可低速离心收集细胞后，进行处理，然后取细胞悬液滴在共聚焦专用盖玻片上直接观察。